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 Aplicación y  fundamentación de los inmunoensayos enzimáticos en las ciencias biomédicas


Primer Simposio Imternacional sobre el uso de la Gonadotrofina Coriónica en la obesidad



Nueva Sección


Universidad Católica Argentina

Curso de Posgrado 
en 
Psicoterapia Simbólica
 
(nueva Ventana)





Autores

Dr. Roberto Lardoeyt Ferrer
Especialista de Primer Grado en Genética Clínica.
ICBP "Victoria de Girón". Ave 146. Esq. a 31 . Reparto Cubanacán. Playa. Teléfono:208 9991-97

Centro Nacional De Genética Medica
Instituto Superior De Ciencias Medicas De La Habana

Resumen

Los estudios inmunohistoquímicos han revolucionado los métodos diagnósticos de muchas enfermedades en el hombre, y la diversidad de procedimientos derivados de estas técnicas han permitido el abordaje molecular de muchas disciplinas como la Oncohematología, la Dermatología, la Genética, entre otras especialidades. 

Esta situación tan especial es debido a que el sistema inmune es por sí mismo el ejemplo de numerosos fenómenos biológicos que son inaparentes o inaccesibles al estudio de otros sistemas. 

Dada su importancia, se realizó una revisión bibliográfica sobre los aspectos teóricos y prácticos de los Inmunoensayos enzimáticos, los sistemas de reconocimiento no inmunológicos, las enzimas que utilizan, los distintos métodos inmunohistoquímicos que existen y su fundamentación, así como su aplicación en las ciencias biomédicas.

Palabras claves: Inmunoensayos enzimáticos, Técnicas inmunohistoquímicas, Inmunología, Anticuerpo, Antígeno, Síndrome de Frágil X.

La Inmunología es la más premiable de todas las disciplinas biológicas, la cual ha sufrido una metamorfosis en los últimos años y ha pasado ser una ciencia interdisciplinaria capaz de generar sus propias técnicas, nociones y productos que son componentes esenciales de la Biología Moderna, entre los que podemos citar los Inmunoensayos Enzimáticos (IEE) y los Anticuerpos Monoclonales (AcMs) (1)

Los IEE se basan en dos estrategias fundamentales: El extraordinario poder discriminatorio de los anticuerpos (Acs), es decir, la reacción entre los inmunorreactantes antígeno- anticuerpo (Ag-Ac); y la detección de esta reacción usando el poder catalítico y específico de las enzimas conjugadas al antígeno (Ag) o al Ac (2).

Los IEE son ventajosos por su elevada sensibilidad, especificidad, detectabilidad, equipamiento relativamente barato, rapidez, simplificidad en la ejecución, reproducibilidad elevada, por no existir riesgo de radiación, los reagentes son relativamente baratos, tienen una vida útil más larga, y por la versatilidad de los ensayos que pueden ser incrementadas por la gran variedad y propiedades específicas de las enzimas (1,2).

Historia de los IEE

Uno de los pioneros en la aplicación de los IEE fue Coons, quien introdujo la técnica de Inmunofluorescencia como proceder histoquímico o citoquímico para la identificación y localización de Ags.

A mediados de la década del 60 se desarrollaron estas técnicas para la identificación y localización de Ags en preparaciones histológicas, análogos a los métodos inmunofluorescentes.

Rubenstein y cols en el año 1972 desarrollaron un sistema homogéneo en la cual la enzima es marcada con un hapteno sin afectar su actividad. Este método es aplicable si el Ac reacciona con el hapteno y reduce o incrementa la actividad enzimática (3).

Desde entonces hasta la fecha se han desarrollado técnicas nuevas o modificaciones de las existentes , incrementándose la variedad de procedimientos que tienen como objetivo principal la necesidad de revelar y amplificar la señal de la presencia de Ags, aún a muy bajas concentraciones a través de la inmunolocalización con Acs.

Sistemas de reconocimiento no inmunológicos usados en los IEE

Existen varios sistemas de reconocimiento no inmunológicos que se emplean en los IEE como sistemas auxiliares: uno de ellos es el complejo avidina- biotina, la proteína A (SpA) y las lectinas (2).
La SpA, proteína aislada de la pared celular del Staphylococcus aureus, tiene una alta afinidad para los fragmentos Fc de muchas inmunoglobulinas (Igs), demostrada por el echo de precipitar a 37 de las 65 Igs de los mamíferos. Esta reactividad hacen de la SpA una herramienta poderosa para el aislamiento selectivo de Ig G o sus subclases, o como marcadores en los IEE.

Esta proteína con un peso variable entre 4200- 5600 dalton, presenta cuatro dominios altamente homólogos capaces de unirse a la Ig.

Las lectinas constituyen el término moderno para designar las glucoproteínas responsables de la actividad de hemoaglutinación previamente denominadas como aglutininas y fitohemaglutininas, ya que su origen no se restringe a las plantas. La nomenclatura de las lectinas varía en dependencia del nombre y el género de la planta de origen (3).

El complejo avidina - biotina se ha convertido en una de las herramientas más importantes para los IEE por las siguientes razones (4):
1- La avidina tiene una alta afinidad por la biotina (1015 M-1)
2- Presenta una alta detectabilidad.
3- La biotina se une con facilidad a los Acs y a muchas enzimas sin ninguna pérdida de su actividad.
4- La Avidina es muy estable y tiene varios sitios de unión, los que pueden ser usados para ligar a otras moléculas biotiniladas.
5- El complejo avidina - biotina tiene una alta estabilidad a la temperatura y a las enzimas proteolíticas.

La avidina es una glucoproteína de la clara del huevo que presenta cuatro subunidades idénticas, cada una de las cuales se une a cuatro moléculas de biotina.
Una proteína similar a la avidina, pero más pequeña es la estreptavidina, la cual proviene del streptomyces avidinii y presenta una ventaja sobre la avidina relacionada con el color del fondo más preciso, mejor definido y de menos intensidad logrando un mejor diagnóstico (2,4).
La biotina constituye uno de los 12 factores solubles en agua del complejo vitamínico B, y es una coenzima para enzimas involucradas en las reacciones de carboxilación (4).

Enzimas usadas en los IEE

Las enzimas más utilizadas en las técnicas para el marcaje de Ags o más frecuentemente de Acs son la Peroxidasa y la Fosfatasa alcalina (FA) de mucosa intestinal de ternera. Esta última es la favorita por su bajo costo, su fácil conjugación y la amplia variedad de sustratos que posee. No obstante existen otras como son: Microperoxidasa, Citocromo C, Glucosa Oxidasa, Acetilcolinesterasa, Anhidrasa Carbónica, Glucomilasa, Ureasa, ß Galactosidasa entre otras (4,5).

Métodos inmunohistoquímicos

Entre los métodos más difundidos en la Inmunología Molecular se encuentran(6):

1. Método Directo: Reacción inmune del Ag con Acs conjugados con enzimas

Este método consiste en la unión de un Ac primario, conjugado con una enzima , con la consiguiente formación del Ac primario conjugado que se une al Ag, visualizándose la reacción Ag- Ac, como se muestra en la siguiente figura:

Figura 1
Método Directo:
Unión de un anticuerpo primario (2) conjugado con una enzima (3), con la consiguiente formación del anticuerpo primario conjugado, que se une al antígeno (1).

2. Método indirecto de dos pasos

En este método existen dos anticuerpos: El Ac primario unido al Ag, que se revela a través de un Ac secundario previamente conjugado con una enzima (anti- Ig), con la consiguiente formación del Ac secundario conjugado que se une al Ac primario, visualizándose la reacción anti- Ig.
Tiene una gran capacidad de detectabilidad, pero la desventaja principal radica en el número incrementado de pasos de incubación y el gran número de controles requeridos (4,6):

Figura 2
Método Indirecto de dos pasos:
El anticuerpo primario (2) unido al antígeno (1) se revela a través de un anticuerpo secundario (3), previamente conjugado con la enzima (4).

3. Método indirecto de tres pasos

Consiste en un Ac terceario conjugado que reacciona con un Ac secundario conjugado previamente, unido al Ac primario.

Figura 3
Método Indirecto de tres pasos:
Anticuerpo terceario (5) conjugado con una enzima (6), reacciona con un anticuerpo secundario (3) conjugado con otra enzima (4), previamente unido al anticuerpo primario (2).

4. Método anticomplemento

Constituye una variante del método indirecto desde que el complemento es antigénico, ya que pueden ser revelados por Acs anti- complemento conjugado con la enzima.

5. Método Complejo Avidina- Biotina

En este método se utiliza la propiedad de la alta afinidad de la avidina o la estreptavidina por la biotina a través del método: Complejo Enzima- Avidina- Biotina (ABC).

La avidina y la biotina pueden ser usadas por diferentes sistemas inmunohistoquímicos. En el método directo, el Ac biotinilado reacciona con una enzima marcada con avidina o una enzima biotinilada se une al Ac biotinilado a través de la avidina (3,4,6,7).

En el método indirecto es similar los hechos explicados anteriormente pero aplicado a un Ac secundario.

Figura 4
Método Complejo Avidina- Biotina:
El método directo consiste en: A) un anticuerpo biotinilado (2) que reacciona con una enzima (5) marcada con avidina (4), ó B) una enzima (6) biotinilada (5) se une al anticuerpo biotinilado (2) a través de la avidina o estreptavidina (4).


6. MICA: Sistema de detección inmunohistoquímica libre de Avidina altamente sensible

La MICA es un acrónimo en inglés para referirse a un nuevo sistema de detección inmunohistoquímica libre de avidina que se basa en la imagen de espejo de Acs complementarios que presenta una elevada sensibilidad comparada con los sistemas de inmunodetección tradicionales.

El principio de este sistema es la aplicación alternativa y subsecuente de Acs policlonales mutuamente atractivos a formar un largo complejo de Acs , el cual puede tener en lace cruzado del tejido unido a Acs primarios (8).

Aplicación de las técnicas inmunohistoquímicas

Desde los trabajos de Coons han sucedido diferentes sistemas de amplificación de señal aumentando la utilidad de estos procedimientos inmunológicos en el campo de la medicina y las investigaciones biomédicas(7).

Es importante para el inmunodiagnóstico en Hematología y Oncología, sobre todo en pacientes con enfermedades linfoproliferativas T y B, enfermedades de Hodking y distintas variedades de Leucemias, ya que la caracterización de células blásticas leucémicas a través de la inmunohistoquímica es un prerrequisito importante en el diagnóstico de certeza de Leucemia Mieloide Aguda y tiene gran impacto sobre la terapia y el pronóstico (9,10).

La Inmunohistoquímica juega un papel esencial en la clasificación de las neoplasias linfohematológicas a través de nuevos marcadores enzimáticos tales como: ALK, foscina, granzima/perforina y triptasa entre otros (9-11).

Han tenido su rol protagónico en el estudio del stress oxidativo, en la cuantificación de los niveles de receptores de estrógeno y progesterona a través de AcMs para el diagnóstico y terapéutica del Cáncer de Mama, en el diagnóstico y pronóstico de células micrometastásicas en Médula Ósea , así como han contribuido en la visualización de la cascada de eventos bioquímicos que ocurren en la apoptosis celular sobre todo en el Sistema Nervioso Central a través de marcadores inmunohistoquímicos como las proteasas, moléculas de transducción de señal entre otras(12-15).

En el campo de la Genética han sido útiles para abordar la fase proteómica del Proyecto Genoma Humano, ya que permite caracterizar los productos génicos, en cuanto a su localización celular, distribución en los órganos y sistemas de órganos, la función que tienen, etc.

Los procederes inmunohistoquímicos han servido para esclarecer algunas incógnitas referentes a bases moleculares o patogenia molecular de muchas enfermedades genéticas como es el caso del Síndrome de Frágil X (SFX), causa más frecuente de retraso mental heredable.

Esta técnica permitió conocer sobre la localización intracitoplasmática del producto del gen FMR-1 involucrado en este síndrome: la proteína FMRP y su expresión en linfocitos humanos, neuronas, células de sertoli, en la raíz del pelo, etc (16,17)

A partir de entonces se abordó el diagnóstico de esta entidad desde otra óptica: demostrando la presencia o ausencia de la proteína FMRP en dichas células a través de sistemas de amplificación inmunocitoquímicas, siendo este proceder el mediador entre la sospecha clínica y la confirmación molecular del SFX, seleccionando a los individuos que verdaderamente requieran de este último estudio.

Estos procederes han sido útiles en la cuantificación y visualización del daño del ADN inducido por la luz UV al generar AcMs específicos contra los fotoproductos, estructuras del ADN dañadas representadas en su mayoría por los dímeros de pirimidina(18)

A través de estos métodos se puede medir la actividad de la enzima Poliadenilato polimerasa (PAP), encargada de formar el tracto de poliadenalina o cadena de Poli A en el extremo 3'del ARN mensajero durante el proceso de maduración, a través de Acs anti PAP. 

La determinación de esta enzima nos puede servir para determinar mecanismos como la proliferación celular, la apoptosis, la espermiogénesis, así como puede ser un marcador para inferir el pronóstico desfavorable en la Leucemia y en el Cáncer de Mama, cuando se encuentra elevada(19)

Han permitido conocer con profundidad posibles mecanismos de producción en enfermedades humanas, sobre todo de procesos tumorales como son el Carcinoma Tiroideo Papilar y el Adenoma Tiroideo Folicular usando dos Acs anti RET, para determinar la función de la proteína RET en la génesis del proceso tumoral(20)

Dada la importancia que reviste la búsqueda inmunohistoquímica de posibles marcadores moleculares en enfermedades premalignas, se han utilizado estos inmunoensayos en la detección de la proteína p53 como técnica complementaria en la Colitis Ulcerativa Idiopática usando el Ac DO-7 para determinar la alta probabilidad de desarrollar Cáncer Colorrectal, y evaluar por tanto el pronóstico (21-23).

La técnica inmunohistoquímica en la dermatología permite diferenciar lesiones que por complementarios de rutina pudieran no identificarse claramente, al estudiar la localización de proteínas específicas, como es el caso de la proteína S100A6 que constituye un marcador del Nevus Spitz (lesión melanocítica benigna), que ofrece dudas en su diagnóstico al presentar componente juncional, pareciéndose al melanoma maligno (24)

Bibliografía

1. Jiménez RR. Los anticuerpos monoclonales en las investigaciones biomédicas. Rev Cub Hematol Inmun. 1985;1:3-31

2. Beltrán PM, Falero GI, Gonzalez AO. Inmunología Experimental. En: Los inmunoensayos enzimáticos. 1.ed. La Habana,1997:1-35

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4. Hsu SM, Raine L, Fanger H. Use of Avidin- Biotin peroxidase complex (ABC) in inmunoperoxidase techniques: A comparison between ABC and labeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem 1981;29:577-80

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Revisado:01/07/2008